danДоклады Национальной академии наук БеларусиDoklady of the National Academy of Sciences of Belarus1561-83232524-2431The Republican Unitary Enterprise Publishing House "Belaruskaya Navuka"10.29235/1561-8323-2022-66-4-404-413dan-1079Research ArticleХИМИЯCHEMISTRYВзаимодействие рекомбинантного лактоферрина человека и вируса SARS-CoV-2 с белковым конъюгатом гепаринаInteraction of recombinant human lactoferrin and SARS-CoV-2 virus to heparin-protein conjugateСеменовД. А.SemenovD. A.

Семенов Дмитрий Александрович – научный сотрудник.

ул. Купревича, 5/2, 220141, Минск

Semenov Dmitry A. – Researcher. I

5/2, Kuprevich Str., 220141, Minsk

dsemenov@iboch.byВашкевичИ. И.VashkevichI. I.

Вашкевич Ирина Игнатьевна – кандидат химических наук, ведущий научный сотрудник. 

ул. Купревича, 5/2, 220141, Минск

Vashkevich Irina I. – Ph. D. (Chemistry), Leading Researcher. 

5/2, Kuprevich Str., 220141, Minsk

vashkevich@iboch.byВладыкоА. С.VladykoA. S.

Владыко Александр Станиславович – доктор медицинских наук, главный научный сотрудник. 

(ул. Филимонова, 23, 220114, Минск

Vladyko Aleksandr S. – D. Sc. (Medicine), Chief Researcher.

23, Filimonov Str., 220114, Minsk

vladyko@belriem.byСвиридовО. В.SviridovO. V.

Свиридов Олег Васильевич – доктор химических наук, заведующий лабораторией. 

ул. Купревича, 5/2, 220141, Минск

Sviridov Oleg V. – D. Sc. (Chemistry), Head of the Laboratory.

5/2, Kuprevich Str., 220141, Minsk

sviridov@iboch.byИнститут биоорганической химии Национальной академии наук БеларусиInstitute of Bioorganic Chemistry of the National Academy of Sciences of BelarusРеспубликанский научно-практический центр эпидемиологии и микробиологииRepublican Research and Practical Center for Epidemiology and Microbiology202208092022664404413Copyright © Семенов Д.А., Вашкевич И.И., Владыко А.С., Свиридов О.В., 20222022Семенов Д.А., Вашкевич И.И., Владыко А.С., Свиридов О.В.Semenov D.A., Vashkevich I.I., Vladyko A.S., Sviridov O.V.Данная работа распространяется под лицензией Creative Commons Attribution 4.0.This work is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 License.https://doklady.belnauka.by/jour/article/view/1079

Преимущества комплекса рекомбинантного лактоферрина человека (рчЛФ) с ионами европия использованы для установления количественных параметров специфического взаимодействия рчЛФ с иммобилизованным белковым конъюгатом гепарина как моделью гепарансульфат протеогликанов клеток. Продукт присоединения гепарина к инертному белку синтезирован в реакции восстановительного аминирования и адсорбирован посредством белковой части в лунках полистирольного микропланшета. Полученный из нативного рчЛФ комплекс рчЛФ–Eu3+ содержит 0,8 моль иона лантанида на моль белка (степень насыщения 40 %). Равновесие в гетерофазной системе связывания устанавливается в течение 1 мин при комнатной температуре, и рассчитанная константа ассоциации комплекса рчЛФ−гепарин составляет 2,1 ‧ 107 М–1. Обратимый и насыщаемый характер связывания с гепарином рчЛФ, меченного по активному центру Eu3+, подтвержден переходом рчЛФ–Eu3+ в жидкую фазу при внесении в систему 1000-кратного мольного избытка немеченного рчЛФ. Выявлен основанный на сродстве рчЛФ к гликозаминогликану блокирующий эффект этого белка на связывание вируса SARS-CoV-2 с иммобилизованным гепаринбелковым конъюгатом, имитирующим протеогликан на поверхности клетки-хозяина. Предварительная обработка адсорбированного конъюгата раствором рчЛФ (10 мкг на лунку) уменьшает примерно на 80 % специфическое связывание 100 нг вирусных частиц, внесенных в лунку. Представленные результаты позволяют, в частности, оценивать целостность структуры и активность рчЛФ в качестве возможной субстанции пищевых добавок и фармацевтических средств и могут быть полезными в разработках комбинированных лекарств от коронавирусной инфекции.

The advantages of the complex of recombinant human lactoferrin (rhLF) with europium ions have been used to establish quantitative parameters of specific interaction of rhLF with immobilized heparin-protein conjugate as a model of cell-surface heparan sulfate proteoglycans. Heparin coupled through terminal formyl by reductive amination to an inert protein was adsorbed through the protein part in the wells of a polystyrene microplate. The rhLF–Eu3+ complex obtained from native rhLF contains 0.8 mol of lanthanide ion per mol of protein (40 % saturation level). Equilibrium in the heterophase binding system is established within 1 min at room temperature, and the calculated association constant of the rhLF-heparin complex is 2.1 × 107 M–1. The reversible and saturable character of binding rhLF labeled by Eu3+ at the active site to heparin was confirmed by the transition of rhLF–Eu3+ into the liquid phase when a 1000-fold molar excess of unlabeled rhLF was added to the system. Based on the affinity of rhLF for glycosaminoglycan, a blocking effect of this protein on the binding of the SARS-CoV-2 virus to the immobilized heparin-protein conjugate that imitates proteoglycan on the host cell surface was revealed. Pretreatment of the adsorbed conjugate with a solution of rhLF (10 µg per well) reduces the specific binding of 100 ng of viral particles added to the well by approximately 80 %. The presented results allow one, in particular, to evaluate the integrity of the structure and activity of rhLF as a possible substance in food supplements and pharmaceuticals and may be useful in developing combined drugs for corona virus infection.

рекомбинантный лактоферрин человекавирус SARS-CoV-2гепарингепарансульфат протеогликаныrecombinant human lactoferrinSARS-CoV-2 virusheparinheparan sulfate proteoglycansReferencesБорзенкова, Н. В. Лактоферрин: физико-химические свойства, биологические функции, системы доставки, лекарственные препараты и биологически активные добавки (обзор) / Н. В. Борзенкова, Н. Г. Балабушевич, Н. И. Ларионова // Биофармацевтический журнал. – 2010. – Т. 2, № 3. – С. 3–19.Borzenkova N. V., Balabushevich N. G., Larionova N. I. Lactoferrin: physical and chemical properties, biological functions, delivery systems, pharmaceutical and nutraceutical preparations (review). Biofarmacevticheskiy jurnal = Biopharmaceutical Journal, 2010, vol. 2, no. 3, pp. 3–19 (in Russian).Mann, D. M. Delineation of the glycosaminoglycan-binding site in the human inflammatory response protein lactoferrin / D. M. Mann, E. Romm, M. Migliorini // J. Biol. Chem. – 1994. – Vol. 269, N 38. – P. 23661–23667. https://doi.org/10.1016/s0021-9258(17)31566-1Mann D. M., Romm E., Migliorini M. Delineation of the glycosaminoglycan-binding site in the human inflammatory response protein lactoferrin. Journal of Biological Chemistry, 1994, vol. 269, no. 38, pp. 23661–23667. https://doi.org/10.1016/s0021-9258(17)31566-1Goats producing biosimilar human lactoferrin / D. M. Bogdanovich [et al.] // IOP Conf. Series: Earth and Environmental Science. – 2021. – Vol. 848, N 1. – Art. 012080. https://doi.org/10.1088/1755-1315/848/1/012080Bogdanovich D. M., Radchikov V. F., Kuznetsova V. N., Petrushko E. V., Spivak M. E., Sivko A. N. Goats producing biosimilar human lactoferrin. IOP Conference Series: Earth and Environmental Science, 2021, vol. 848, no. 1, art. 012080. https://doi.org/10.1088/1755-1315/848/1/012080Получение рекомбинантного лактоферрина человека из молока коз-продуцентов и его физиологические эффекты / В. С. Лукашевич [и др.] // Докл. Нац. акад. наук Беларуси. – 2016. – Т. 60, № 1. – С. 72–81.Lukashevich V. S., Budzevich A. I., Semak I. V., Kuznetsova V. N., Malyushkova E. V., Pyzh A. E., Novakovskaya S. A., Rudnichenko J. A., Popkov N. A., Ivashkevich O. A., Zalutsky I. V. Production of recombinant human lactoferrin from the milk of goat-producers and its physiological effects. Doklady Natsional’noi akademii nauk Belarusi = Doklady of the National Academy of Sciences of Belarus, 2016, vol. 60, no. 1, pp. 72–81 (in Russian).Антимикробные и антиоксидантные свойства апо-формы рекомбинантного человеческого лактоферрина, выделенного из молока коз-продуцентов / Р. Н. Бирюков [и др.] // Микробные биотехнологии: фундаментальные и прикладные аспекты. – 2017. – Т. 9. – С. 305–317.Birukou R. N., Kastsianevich А. А., Kapustin M. A., Falkouskaya U. V., Chubarova H. S., Hubchyk K. A. Antimicrobial and antioxidant properties of apoform of recombinant human lactoferrin isolated from goat milk. Mikrobnye biotehnologii: fundamental’nye i prikladnye aspekty = Microbial biotechnologies: fundamental and applied aspects, 2017, vol. 9, pp. 305– 317 (in Russian).Некоторые металлсвязывающие свойства рекомбинантного лактоферрина человека из молока трансгенных коз / Д. А. Семенов [и др.] // Докл. Нац. акад. наук Беларуси. – 2022. – Т. 66, № 1. – С. 43–54. https://doi.org/10.29235/15618323-2022-66-1-43-54Semenov D. A., Kuprienko O. S., Vashkevich I. I., Sviridov O. V. Some metal binding properties of recombinant human lactoferrin from the milk of transgenic goats. Doklady Natsional’noi akademii nauk Belarusi = Doklady of the National Academy of Sciences of Belarus, 2022, vol. 66, no. 1, pp. 43–54 (in Russian). https://doi.org/10.29235/1561-8323-2022-66-1-43-54Семенов, Д. А. Новые иммуноаналитические системы на основе рекомбинантного лактоферрина человека / Д. А. Семенов, И. И. Вашкевич, О. В. Свиридов // Докл. Нац. акад. наук Беларуси. – 2021. – Т. 65, № 3. – С. 290–302. https://doi.org/10.29235/1561-8323-2021-65-3-290-302Semenov D. A., Vashkevich I. I., Sviridov O. V. New immunoassay systems based on recombinant human lactoferrin. Doklady Natsional’noi akademii nauk Belarusi = Doklady of the National Academy of Sciences of Belarus, 2021, vol. 65, no. 3, pp. 290–302 (in Russian). https://doi.org/10.29235/1561-8323-2021-65-3-290-302N-terminal stretch Arg2, Arg3, Arg4 and Arg5 of human lactoferrin is essential for binding to heparin, bacterial lipopolysaccharide, human lysozyme and DNA / P. H. C. van Berkel [et al.] // Biochem. J. – 1997. – Vol. 328, N 1. – P. 145–151. https://doi.org/10.1042/bj3280145Van Berkel P. H. C., Geerts E. J. M., van Veen A. H., Mericskay M., de Boer A. H., Nuijens J. H. N-terminal stretch Arg2, Arg3, Arg4 and Arg5 of human lactoferrin is essential for binding to heparin, bacterial lipopolysaccharide, human lysozyme and DNA. Biochemical Journal, 1997, vol. 328, no. 1, pp. 145–151. https://doi.org/10.1042/bj3280145Hermanson, G. T. Bioconjugate techniques / G. T. Hermanson. – 3rd ed. – Academic Press, 2013. – P. 217–218. https://doi.org/10.1016/C2009-0-64240-9Hermanson G. T. Bioconjugate techniques, Third Edition. Academic Press, 2013, pp. 217–218. https://doi.org/10.1016/C2009-0-64240-9Direct detection of the binding of avidin and lactoferrin fluorescent probes to heparinized surfaces / W. C. Kett [et al.] // Analytical Biochemistry. – 2005. – Vol. 339, N 2. – P. 206–215. https://doi.org/10.1016/j.ab.2005.01.054Kett W. C., Osmond R. I. W., Stevenson S. M., Moe L., Coombe D. R. Direct detection of the binding of avidin and lactoferrin fluorescent probes to heparinized surfaces. Analytical Biochemistry, 2005, vol. 339, no. 2, pp. 206–215. https://doi.org/10.1016/j.ab.2005.01.054Pejler, G. Lactoferrin regulates the activity of heparin proteoglycan-bound mast cell chymase: characterization of the binding of heparin to lactoferrin / G. Pejler // Biochem. J. – 1996. – Vol. 320, N 3. – P. 897–903. https://doi.org/10.1042/bj3200897Pejler G. Lactoferrin regulates the activity of heparin proteoglycan-bound mast cell chymase: characterization of the binding of heparin to lactoferrin. Biochemical Journal, 1996, vol. 320, no. 3, pp. 897–903. https://doi.org/10.1042/bj3200897Avidin is a heparin-binding protein. Affinity, specificity and structural analysis / W. C. Kett [et al.] // Biochimica et Biophysica Acta. – 2003. – Vol. 1620, N 1–3. – P. 225–234. https://doi.org/10.1016/s0304-4165(02)00539-1Kett W. C., Osmond R. I. W., Moe L., Skett S. E., Kinnear B. F., Coombe D. R. Avidin is a heparin-binding protein. Affinity, specificity and structural analysis. Biochimica et Biophysica Acta, 2003, vol. 1620, no. 1–3, pp. 225–234. https://doi.org/10.1016/s0304-4165(02)00539-1Morphological cell profiling of SARS-CoV-2 infection identifies drug repurposing candidates for COVID-19 / C. Mirabelli [et al.] // PNAS. – 2021. – Vol. 118, N 36. – Art. e2105815118. https://doi.org/10.1073/pnas.2105815118Mirabelli C., Wotring J. W., Zhang C. J., McCarty S. M., Fursmidt R., Pretto C. D., Qiao Y., Zhang Y., Frum T., Kadambi N. S., Amin A. T., O’Meara T. R., Spence J. R., Huang J., Alysandratos K. D., Kotton D. N., Handelman S. K., Wobus C. E., Weatherwax K. J., Mashour G. A., O’Meara M. J., Chinnaiyan A. M., Sexton J. Z. Morphological cell profiling of SARS-CoV-2 infection identifies drug repurposing candidates for COVID-19. PNAS, 2021, vol. 118, no. 36, art. e2105815118. https://doi.org/10.1073/pnas.2105815118Inhibition of SARS pseudovirus cell entry by lactoferrin binding to heparan sulfate proteoglycans / J. Lang [et al.] // PLoS ONE. – 2011. – Vol. 6, N 8. – Art. e23710. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0023710Lang J., Yang N., Deng J., Liu K., Yang P., Zhang G., Jiang C. Inhibition of SARS pseudovirus cell entry by lactoferrin binding to heparan sulfate proteoglycans. PLoS ONE, 2011, vol. 6, no. 8, art. e23710. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0023710

The authors declare that there are no conflicts of interest present.