danДоклады Национальной академии наук БеларусиDoklady of the National Academy of Sciences of Belarus1561-83232524-2431The Republican Unitary Enterprise Publishing House "Belaruskaya Navuka"10.29235/1561-8323-2025-69-5-404-415dan-1275Research ArticleМЕДИЦИНАMEDICINEМодифицированная лентивирусная векторная система для эффективного введения и долговременной экспрессии генов в дендритных клетках человекаModified lentiviral vector system for efficient delivery and long-term gene expression in human dendritic cellshttps://orcid.org/0009-0000-3464-5200ПилютинаО. Ю.PiliutinaO. Yu.

Пилютина Ольга Юрьевна – науч. сотрудник. РНПЦ трансфузиологии и медицинских биотехнологий.

Долгиновский тракт, 160, 220053, Минск

Piliutina Olga Yu. – Researcher. Republican Scientific and Practical Center for Transfusiology and Medical Biotechnology.

160, Dolginovsky tract, 220053, Minsk

piliutinao@gmail.comhttps://orcid.org/0009-0008-3794-6429ВойтеховичА. С.VoytehovichA. S.

Войтехович Александр Сергеевич – науч. сотрудник. РНПЦ трансфузиологии и медицинских биотехнологий.

Долгиновский тракт, 160, 220053, Минск

Voytehovich Alexander S. – Researcher. Republican Scientific and Practical Center for Transfusiology and Medical Biotechnology.

160, Dolginovsky tract, 220053, Minsk

voytehovichas@gmail.comhttps://orcid.org/0000-0003-3028-1176ФоминаЕ. Г.FominaE. G.

Фомина Елена Георгиевна – д-р биол. наук, заведующий лабораторией.

Ул. Филимонова, 23, 220114

Fomina Elena G. – D. Sc. (Biology), Head of the Laboratory.

23, Filimonov Str., 220114, Minsk

feg1@tut.byhttps://orcid.org/0000-0003-3919-0625ГригорьеваЕ. Е.GrigorievaE. E.

Григорьева Елена Евгеньевна – канд. биол. наук, вед. науч. сотрудник, доцент.

Ул. Филимонова, 23, 220114, Минск

Grigorieva Elena E. – Ph. D. (Biology), Leading Researcher, Associate Professor.

23, Filimonov Str., 220114, Minsk

grigus@mail.ruhttps://orcid.org/0009-0006-1921-5978ФоминИ. К.FominI. K.

Фомин Игорь Климентьевич – канд. биол. наук, вед. науч. сотрудник.

Долгиновский тракт, 160, 220053, Минск

Fomin Igor K. – Ph. D. (Biology), Leading Researcher.

160, Dolginovsky tract, 220053, Minsk

rrlmb27@gmail.comРеспубликанский научно-практический центр трансфузиологии и медицинских биотехнологийRepublican Scientific and Practical Center of Transfusiology and Medical BiotechnologyРеспубликанский центр гигиены, эпидемиологии и общественного здоровьяRepublican Center for Hygiene, Epidemiology and Public Health202506112025695404415Copyright © Пилютина О.Ю., Войтехович А.С., Фомина Е.Г., Григорьева Е.Е., Фомин И.К., 20252025Пилютина О.Ю., Войтехович А.С., Фомина Е.Г., Григорьева Е.Е., Фомин И.К.Piliutina O.Y., Voytehovich A.S., Fomina E.G., Grigorieva E.E., Fomin I.K.Данная работа распространяется под лицензией Creative Commons Attribution 4.0.This work is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 License.https://doklady.belnauka.by/jour/article/view/1275

Дендритные клетки (ДК) содержат высокую концентрацию антивирусного фактора SAMHD1, который ингибирует размножение лентивирусов. Некоторые представители лентивирусов обезьян, такие как SIVmac, кодируют вспомогательный белок Vpx, который является антогонистом SAMHD1 и блокирует его действие в инфицируемых клетках для повышения эффективности размножения. Однако лентивирус человека HIV-1, на основе которого получены подавляющее большинство векторных систем для введения и экспрессии генов, не кодирует Vpx и инфицирует ДК с низкой эффективностью. Исходя из этого, было сделано предположение, что упаковка Vpx белка SIVmac в вирионы лентивирусных векторов на основе HIV-1 может увеличивать их инфекционность на ДК. Для придания лентивирусной векторной системе на основе HIV-1 способности упаковывать в вирионы белок Vpx SIVmac239 в векторную систему были введены ряд изменений. На основе анализа структурной и функциональной гомологии белков p6 HIV-1 и SIVmac239 были определены аминокислотные последовательности, замена которых в составе p6 HIV-1 позволяла бы специфически упаковывать экзогенный белок Vpx SIVmac239 и оказывала минимальное влияние на структуру белка. Для экспрессии белка Vpx SIVmac239 в клетках человека была получена кодон-оптимизированная последовательность гена Vpx. Результаты показали, что упаковка Vpx белка в вирионы модифицированных лентивирусов является критичной для их инфекционности на ДК, так как вирус «дикого типа», полученный даже в присутствии Vpx белка, был не способен продуктивно инфицировать ДК, поскольку не содержит белковых детерминант для упаковки Vpx. Эффективность введения маркерного гена в ДК при помощи модифицированной векторной системы для различных доноров составила 90–97 %. Отличительной особенностью векторной системы является ее способность упаковывать Vpx белок SIVmac непосредственно в вирионы HIV-1, что дает возможность напрямую вводить вирусные векторы на основе HIV-1 в ДК, без предварительной их обработки обезьяньим вирусом SIVmac. Таким образом, модифицированная векторная система может быть использована для эффективного введения и долговременной экспрессии генов в ДК человека.

Dendritic cells (DC) contain a high concentration of the antiviral factor SAMHD1, which inhibits the replication of lentiviruses. Some representatives of monkey lentiviruses, such as SIVmac, encode the accessory protein Vpx, which is an antagonist of SAMHD1 and blocks its action in infected cells to increase the efficiency of replication. However, the human lentivirus HIV-1, which is the basis for the vast majority of vector systems for the introduction and expression of genes, does not encode Vpx and infects DC with low efficiency. Based on this, it has been suggested that packaging of the SIVmac Vpx protein into HIV-1 lentiviral vector virions may increase their infectivity on DC. To enable the HIV-1-based lentiviral vector system to package the Vpx protein of SIVmac239 into virions, a number of modifications were introduced into the vector system. Based on the analysis of the structural and functional homology of the proteins p6 HIV-1 and SIVmac239, amino acid sequences were identified, the replacement of which in the composition of p6 HIV-1 would allow specific packaging of the exogenous Vpx protein SIVmac239, and have a minimal effect on the structure of the protein. To express the SIVmac239 Vpx protein in human cells, a codon-optimized sequence of the Vpx gene was obtained. The results showed that packaging of the Vpx protein into the virions of modified lentiviruses is critical for their infectivity on DC, since the “wild-type” virus, even obtained in the presence of the Vpx protein, was unable to productively infect DC because it does not contain the protein determinants for packaging Vpx. The efficiency of introducing a marker gene into DC using the modified vector system for different donors was 90–97 %. A distinctive feature of the vector system is its ability to package the SIVmac Vpx protein directly into HIV-1 virions, which makes it possible to directly introduce HIV-1-based viral vectors into DC without pre-treatment with the simian SIVmac virus. Thus, the modified vector system can be used for efficient transfer and long-term gene expression in human DC.

лентивирусылентивирусные векторыVpxдендритные клеткиэкспрессия геновlentiviruseslentiviral vectorsVpxdendritic cellsgene expressionРабота выполнена при финансовой поддержке Министерства здравоохранения Республики Беларусь (ГПНИ «Фундаментальные и прикладные науки – медицине», 2016–2020, подпрограмма 2 «Диагностика и терапия заболеваний», задание 2.146 (Рег. № 20200252, 2020 год) и ГПНИ «Биотехнология-2», 2021–2025, подпрограмма «Молекулярные и клеточные биотехнологии-2», задание 1.14 (Рег. № 20220282, 2022–2024 гг.))The work was carried out with the financial support of the Ministry of Health of the Republic of Belarus (SPSR “Fundamental and Applied Sciences – Medicine”, 2016–2020, subprogram 2 “Diagnostics and Therapy of Diseases”, task 2.146 (Reg. No. 20200252, 2020), and SPSR “Biotechnology-2”, 2021–2025, subprogram “Molecular and Cellular Biotechnology-2”, task 1.14 (Reg. No. 20220282, 2022-2024))ReferencesSteinman, R. M. Decisions about dendritic cells: past, present, and future / R. M. Steinman // Annual Review of Immunology. – 2012. – Vol. 30. – P. 1–22. https://doi.org/10.1146/annurev-immunol-100311-102839Steinman R. M. Decisions about dendritic cells: past, present, and future. Annual Review of Immunology, 2012, vol. 30, pp. 1–22. https://doi.org/10.1146/annurev-immunol-100311-102839Steinman, R. M. Taking dendritic cells into medicine / R. M. Steinman, J. Banchereau // Nature. – 2007. – Vol. 449. – P. 419–426. https://doi.org/10.1038/nature06175Steinman R. M, Banchereau J. Taking dendritic cells into medicine. Nature, 2007, vol. 449, pp. 419–426. https://doi. org/10.1038/nature06175Targeted delivery of TLR ligands to human and mouse dendritic cells strongly enhances adjuvanticity / P. J. Tacken, I. S. Zeelenberg, L. J. Cruz [et al.] // Blood. – 2011. – Vol. 118, N 26. – P. 6836–6844. https://doi.org/10.1182/blood-2011-07-367615Tacken P. J., Zeelenberg I. S., Cruz L. J., van Hout-Kuijer M. A., van de Glind G., Fokkink R. G., Lambeck A. J. A., Figdor C. G. Targeted delivery of TLR ligands to human and mouse dendritic cells strongly enhances adjuvanticity. Blood, 2011, vol. 118, no. 26, pp. 6836–6844. https://doi.org/10.1182/blood-2011-07-367615Naldini, L. Lentiviruses as gene transfer agents for delivery to non-dividing cells / L. Naldini // Current Opinion in Biotechnology. – 1998. – Vol. 9, N 5. – P. 457–463. https://doi.org/10.1016/s0958-1669(98)80029-3Naldini L. Lentiviruses as gene transfer agents for delivery to non-dividing cells. Current Opinion in Biotechnology, 1998, vol. 9, no. 5, pp. 457–463. https://doi.org/10.1016/s0958-1669(98)80029-3SAMHD1 restricts the replication of human immunodeficiency virus type 1 by depleting the intracellular pool of deoxynucleoside triphosphates / H. Lahouassa, W. Daddacha, H. Hofmann [et al.] // Nature Immunology. – 2012. – Vol. 13. – P. 223–228. https://doi.org/10.1038/ni.2236Lahouassa H., Daddacha W., Hofmann H., Ayinde D., Logue E. C., Dragin L., Bloch N., Maudet C., Bertrand M., Gramberg T., Pancino G., Priet S., Canard B., Laguette N., Benkirane M., Transy C., Landau N. R., Kim B., Margottin-Goguet F. SAMHD1 restricts the replication of human immunodeficiency virus type 1 by depleting the intracellular pool of deoxynucleoside triphosphates. Nature Immunology, 2012, vol. 13, pp. 223–228. https://doi.org/10.1038/ni.2236SAMHD1 is the dendriticand myeloid-cell-specific HIV-1 restriction factor counteracted by Vpx / N. Laguette, B. Sobhian, N. Casartelli [et al.] // Nature. – 2011. – Vol. 474. – P. 654–657. https://doi.org/10.1038/nature10117Laguette N., Sobhian B., Casartelli N., Ringeard M., Chable-Bessia C., Ségéral E., Yatim A., Emiliani S., Schwartz O., Benkirane M. SAMHD1 is the dendriticand myeloid-cell-specific HIV-1 restriction factor counteracted by Vpx. Nature, 2011, vol. 474, pp. 654–657. https://doi.org/10.1038/nature10117Vpx relieves inhibition of HIV-1 infection of macrophages mediated by the SAMHD1 protein / K. Hrecka, C. Hao, M. Gierszewska [et al.] // Nature. – 2011. – Vol. 474. – P. 658–661. https://doi.org/10.1038/nature10195Hrecka K., Hao C., Gierszewska M., Swanson S. K., Kesik-Brodacka M., Srivastava S., Florens L., Washburn M. P., Skowronski J. Vpx relieves inhibition of HIV-1 infection of macrophages mediated by the SAMHD1 protein. Nature, 2011, vol. 474, pp. 658–661. https://doi.org/10.1038/nature10195With a little help from a friend: increasing HIV transduction of monocyte-derived dendritic cells with virion-like particles of SIVMAC / C. Goujon, L. Jarrosson-Wuilleme, J. Bernaud [et al.] // Gene Therapy. – 2006. – Vol. 13. – P. 991–994. https://doi.org/10.1038/sj.gt.3302753Goujon C., Jarrosson-Wuillème L., Bernaud J., Rigal D., Darlix J. L., Cimarelli A. With a little help from a friend: increasing HIV transduction of monocyte-derived dendritic cells with virion-like particles of SIVMAC. Gene Therapy, 2006, vol. 13, pp. 991–994. https://doi.org/10.1038/sj.gt.3302753A cryptic sensor for HIV-1 activates antiviral innate immunity in dendritic cells / N. Manel, B. Hogstad, Ya. Wang [et al.] // Nature. – 2010. – Vol. 467. – P. 214–217. https://doi.org/10.1038/nature09337Manel N., Hogstad B., Wang Ya., Levy D. E., Unutmaz D., Littman D. R. A cryptic sensor for HIV-1 activates antiviral innate immunity in dendritic cells. Nature, 2010, vol. 467, pp. 214–217. https://doi.org/10.1038/nature09337Sambrook, J. F. Molecular cloning: a laboratory manual / J. Sambrook. – Cold Spring Harbor, 2001. – 3d ed.Sambrook J. Molecular cloning: a laboratory manual, 3d ed. Cold Spring Harbor, 2001.A conserved dileucine-containing motif in p6gag governs the particle association of Vpx and Vpr of simian immunodeficiency viruses SIVmac and SIVagm / M. A. Accola, A. A. Bukovsky, M. S. Jones, H. G. Gottlinger // Journal of Virology. – 1999. – Vol. 73, N 12. – P. 9992–9999. https://doi.org/10.1128/JVI.73.12.9992-9999.1999Accola M. A., Bukovsky A. A., Jones M. S., Göttlinger H. G. A conserved dileucine-containing motif in p6(gag) governs the particle association of Vpx and Vpr of simian immunodeficiency viruses SIV(mac) and SIV(agm). Journal of Virology, 1999, vol. 73, no. 12, pp. 9992–9999. https://doi.org/10.1128/JVI.73.12.9992-9999.1999Solution structure of the human immunodeficiency virus type 1 p6 protein / T. Fossen, V. Wray, K. Bruns [et al.] // Journal of Biological Chemistry. – 2005. – Vol. 280, N 52. – P. 42515–42527. https://doi.org/10.1074/jbc.M507375200Fossen T., Wray V., Bruns K., Rachmat J., Henklein P., Tessmer U., Maczurek A., Klinger P., Schubert U. Solution structure of the human immunodeficiency virus type 1 p6 protein. Journal of Biological Chemistry, 2005, vol. 280, no. 52, pp. 42515–42527. https://doi.org/10.1074/jbc.M507375200Identification and structural characterization of the ALIX-binding late domains of simian immunodeficiency virus SIVmac239 and SIVagmTan-1 / Q. Zhai, M. B. Landesman, H. Robinson [et al.] // Journal of Virology. – 2011. – Vol. 85, N 1. – P. 632–637. https://doi.org/10.1128/JVI.01683-10Zhai Q., Landesman M. B., Robinson H., Sundquist W. I., Hill C. P. Identification and structural characterization of the ALIX-binding late domains of simian immunodeficiency virus SIVmac239 and SIVagmTan-1. Journal of Virology, 2011, vol. 85, no. 1, pp. 632–637. https://doi.org/10.1128/JVI.01683-10Kondo, E. A conserved LXXLF sequence is the major determinant in p6gag required for the incorporation of human immunodeficiency virus type 1 Vpr / E. Kondo, H. G. Gottinger // Journal of Virology. – 1996. – Vol. 70, N 1. – P. 159–164. https://doi.org/10.1128/JVI.70.1.159-164.1996Kondo E., Göttlinger H. G. A conserved LXXLF sequence is the major determinant in p6gag required for the incorporation of human immunodeficiency virus type 1 Vpr. Journal of Virology, 1996, vol. 70, no. 1, pp. 159–164. https://doi. org/10.1128/JVI.70.1.159-164.1996.Zhu, H. Identification of the 15FRFG domain in HIV-1 Gag p6 essential for Vpr packaging into the virion / H. Zhu, H. Jian, L. J. Zhao // Retrovirology. – 2004. – Vol. 1. – Art. 26. https://doi.org/10.1186/1742-4690-1-26Zhu H., Jian H., Zhao L. J. Identification of the 15FRFG domain in HIV-1 Gag p6 essential for Vpr packaging into the virion. Retrovirology, 2004, vol. 1, art. 26. https://doi.org/10.1186/1742-4690-1-26

The authors declare that there are no conflicts of interest present.