danДоклады Национальной академии наук БеларусиDoklady of the National Academy of Sciences of Belarus1561-83232524-2431The Republican Unitary Enterprise Publishing House "Belaruskaya Navuka"10.29235/1561-8323-2020-64-1-71-77dan-856Research ArticleБИОЛОГИЯBIOLOGYБиосинтез браззеина в бактериальной системе бесклеточного синтеза белкаBiosynthesis of brazzein using the bacterial cell-free protein synthesis systemКазловскийИ. С.KazlouskiI. S.

Казловский Илья Сергеевич - магистр биол. наук, научный сотрудник.

Ул. Купревича, 2, 220141, Минск

Kazlouski Illia S. - Master of Biology, Researcher.

kazlouski.illia@gmail.comБельскаяИ. В.BelskayaI. V.

Бельская Инна Валерьевна - магистр биол. наук, младший научный сотрудник.

Ул. Филимонова, 23, 220114, Минск

Belskaya Ina V. - Master of Biology, Junior researcher.

23, Filimonov Str., 220114, Minsk

v.inna.belskaya@gmail.comЗинченкоА. И.ZinchenkoА. I.

Зинченко Анатолий Иванович - член-корреспондент, доктор биологических наук, профессор, заведующий лабораторией.

Ул. Купревича, 2, 220141, Минск

Zinchenko Anatoliy I. - Corresponding Member, D. Sc. (Biology), Professor, Head of the Laboratory.

2, Kuprevich Str., 220141, Minsk

zinch@mbio.bas-net.byИнститут микробиологии, Национальная академия наук БеларусиInstitute of Microbiology, National Academy of Sciences of BelarusРеспубликанский научно-практический центр эпидемиологии и микробиологииRepublican Research and Practical Center for Epidemiology and Microbiology2020200320206417177Copyright © Казловский И.С., Бельская И.В., Зинченко А.И., 20202020Казловский И.С., Бельская И.В., Зинченко А.И.Kazlouski I.S., Belskaya I.V., Zinchenko А.I.Данная работа распространяется под лицензией Creative Commons Attribution 4.0.This work is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 License.https://doklady.belnauka.by/jour/article/view/856

В настоящем исследовании в качестве варианта, альтернативного каноническому глубинному культивированию в ферментере, была изучена возможность синтеза сладкого растительного белка браззеина в бактериальной системе бесклеточного синтеза белка (БСБ). Для синтеза этого фермента использовали S30-клеточный экстракт Escherichia coli, химерную РНК-полимеразу бактериофага Т7 и высококопийный плазмидный вектор pET42mut со встроенным в него геном браззеина. В результате выполнения работы впервые продемонстрирована возможность синтеза сладкого белка в системе БСБ. При этом объемный выход браззеина в оптимизированных условиях проведения процесса составил 2 мг/мл реакционой смеси, что в 57 раз больше, чем максимальный выход его в ранее описанных в литературе экспериментах с использованием цельноклеточных систем экспрессии.

Feasibility of producing brazzein plant sweetener by the cell-free biosynthesis procedure as an alternative to the classical submerged fermentation method was assessed in the present investigation. Chimeric RNA polymerase of T7 bacteriophage, S30-cell extract of Escherichia coli and multicopy plasmid vector pET42mut with the inserted brazzein gene were included into the protein synthesis. The completed research resulted in the first successful demonstration of the sweet protein biosynthesis in the cell-free system. The volumetric brazzein yield under optimized process conditions was 2 mg/ml of the reaction mixture, exceeding 57 times the maximum values that had been achieved in the previous studies applying whole-cell expression systems.

браззеинсахарозаменительEscherichia coliбесклеточный синтез белкавысококопийная pET42mut-плазмидаbrazzeinsugar substituteEscherichia colicell-free protein synthesis systemmulticopy pET42mut plasmidReferencesЕгорова, И. А. О пользе и вреде сахарозаменителей / И. А. Егорова, С. Г Комарова // Усп. в хим. и хим. техн. -2015. - Т. 29, № 2. - С. 51-53.Egorova I. A., Komarova S. G. About the benefits and dangers of sugar substitutes. Uspekhi v khimii i khimicheskoi tekhnologii = Advances in Chemistry and Chemical Technology, 2015, vol. 29, no. 2, pp. 51-53 (in Russian).Жаббарова, С. К. Влияние сахарозаменителей и подсластителей на безвредность кондитерских изделий / С. К. Жаббарова // Universum: Технические науки. - 2019. - № 2 [Электронный ресурс]. - Режим доступа: http://7universum.com/ru/tech/archive/item/6953. - Дата доступа: 25.07.2019.Jabbarova S. K. Influence of sugar-substitute and sweeteners on the safety of confectioners products. Universum: Tech-nicheskie nauki = Universum: Technical Science, 2019, no. 2. Available at: http://7universum.com/ru/tech/archive/item/6953 (accessed 25 July 2019).Faus, I. Recent developments in the characterization and biotechnological production of sweet-tasting proteins /I. Faus // Appl. Microbiol. Biotechnol. - 2000. - Vol. 53, N 2. - P. 145-151. https://doi.org/10.1007/s002530050001Faus I. Recent developments in the characterization and biotechnological production of sweet-tasting proteins. Applied Microbiology and Biotechnology, 2000, vol. 53, no. 2, pp. 145-151. https://doi.org/10.1007/s002530050001Hellekant, G. Primate sense of taste: behavioral and single chorda tympani and glossopharyngeal nerve fiber recordings in the rhesus monkey, Macaca mulatta / G. Hellekant, V. Danilova, Y. Ninomiya // J. Neurophysiol. - 1997. - Vol. 77, N 2. - P. 978-993. https://doi.org/10.1152/jn.199777.2.978Hellekant G., Danilova V., Ninomiya Y. Primate sense of taste: behavioral and single chorda tympani and glossopharyngeal nerve fiber recordings in the rhesus monkey, Macaca mulatta. Journal of Neurophysiology, 1997, vol. 77, no. 2, pp. 978-993. https://doi.org/10.1152/jn.1997.77.2.978Ming, D. Brazzein, a new high-potency thermostable sweet protein from Pentadiplandra brazzeana / D. Ming, G. Hellekant // FEBS Lett. - 1994. - Vol. 355, N 1. - P. 106-108. https://doi.org/10.1016/0014-5793(94)01184-2Ming D., Hellekant G. Brazzein, a new high-potency thermostable sweet protein from Pentadiplandra brazzeana. FEBS Letters, 1994, vol. 355, no. 1, pp. 106-108. https://doi.org/10.1016/0014-5793(94)01184-2Efficient production and characterization of the sweet-tasting brazzein secreted by the yeast Pichiapastoris / N. Poirier [et al.] // J. Agric. Food. Chem. - 2012. - Vol. 60, N 39. - P. 9807-9814. https://doi.org/10.1021/jf301600mPoirier N., Roudnitzky N., Brockhoff A., Belloir C., Maison M., Thomas-Danguin T., Meyerhof W., Briand L. Efficient production and characterization of the sweet-tasting brazzein secreted by the yeast Pichia pastoris. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2012, vol. 60, no. 39, pp. 9807-9814. https://doi.org/10.1021/jf301600mThe recent development of a sweet-tasting brazzein and its potential industrial applications / F. Neiers [et al.] // Reference Series in Phytochemistry. - Springer Int. Publ., 2016. - P. 1-20. https://doi.org/10.1007/978-3-319-26478-3_2-1Neiers F., Naumer C., Krohn M., Briand L. The recent development of a sweet-tasting brazzein and its potential industrial applications. Reference Series in Phytochemistry. Springer International Publishing, 2016, pp. 1-20. https://doi.org/10.1007/978-3-319-26478-3_2-1Creating cell-free protein synthesis factories / C. Heide [et al.] // Pharm. Bioprocess. - 2018. - Vol. 6, N 1. - P. 3-6.Heide C., Ces O., Polizzi K. M., Kontoravdi C. Creating cell-free protein synthesis factories. Pharmaceutical Bioprocessing, 2018, vol. 6, no. 1, pp. 3-6.Казловский, И. С. Модификация экспрессионной pET-системы для использования в бесклеточном синтезе белка / И. С. Казловский, А. Н. Рымко, А. И. Зинченко // Микробные биотехнологии: фундаментальные и прикладные аспекты. - Минск, 2018. - Т. 10. - С. 69-78.Kazlovskiy I. S., Rymko A. N., Zinchenko A. I. Modification of expression system of pET for using in cell-free protein synthesis. Mikrobnye biotekhnologii: fundamental’nye i prikladnye aspekty [Microbial biotechnologies: basic and applied aspects]. Minsk, 2018, vol. 10, pp. 69-78 (in Russian).Казловский, И. С. Создание штамма-продуцента химерного белка, состоящего из РНК-полимеразы и ДНК-аффинного домена / И. С. Казловский, А. И. Зинченко // Докл. Нац. акад. наук Беларуси. - 2018. - Т. 62, № 5. - С. 601607. https://doi.org/10.29235/1561-8323-2018-62-5-601-607Kazlovskiy I. S., Zinchenko A. I. Construction of a strain-producer of the chimeric protein consisting of RNA polymerase and a DNA-affinity domain. Doklady Natsional ’noi akademii nauk Belarusi = Doklady of the National Academy of Sciences of Belarus, 2018, vol. 62, no. 5, pp. 601-607 (in Russian). https://doi.org/10.29235/1561-8323-2018-62-5-601-607Peterson, G. L. A simplification of the protein assay method of Lowry et al. which is more generally applicable / G. L. Peterson // Anal. Biochem. - 1977. - Vol. 83, N 2. - P. 346-356. https://doi.org/10.1016/0003-2697(77)90043-4Peterson G. L. A simplification of the protein assay method of Lowry et al. which is more generally applicable. Analytical Biochemistry, 1977, vol. 83, no. 2, pp. 346-356. https://doi.org/10.1016/0003-2697(77)90043-4Expression of the sweet-tasting plant protein brazzein in Escherichia coli and Lactococcus lactis: a path toward sweet lactic acid bacteria / A. Berlec [et al.] // Appl. Microbiol. Biotechnol. - 2006. - Vol. 73, N 1. - P. 158-165. https://doi.org/10.1007/s00253-006-0438-yBerlec A., Jevnikar Z., Majhenic A. C., Rogelj I., Strukelj B. Expression of the sweet-tasting plant protein brazzein in Escherichia coli and Lactococcus lactis: a path toward sweet lactic acid bacteria. Applied Microbiology and Biotechnology, 2006, vol. 73, no. 1, pp. 158-165. https://doi.org/10.1007/s00253-006-0438-yA novel strategy to engineer DNA polymerases for enhanced processivity and improved performance in vitro / Y. Wang [et al.] // Nucleic Acids Res. - 2004. - Vol. 32, N 3. - P. 1197-1207.Wang Y., Prosen D. E., Mei L., Sullivan J. C., Finney M., Vander-Horn P. B. A novel strategy to engineer DNA polymerases for enhanced processivity and improved performance in vitro. Nucleic Acids Research, 2004, vol. 32, no. 3, pp. 11971207. https://doi.org/10.1093/nar/gkh271Baneyx, F. Recombinant protein expression in Escherichia coli / F. Baneyx // Curr. Opin. Biotechnol. - 1999. -Vol. 10, N 5. - P. 411-421. https://doi.org/10.1016/s0958-1669(99)00003-8Baneyx F. Recombinant protein expression in Escherichia coli. Current Opinion in Biotechnology, 1999. vol. 10, no. 5, pp. 411-421. https://doi.org/10.1016/s0958-1669(99)00003-8

The authors declare that there are no conflicts of interest present.