Создание штамма-продуцента химерного белка, состоящего из РНК-полимеразы и ДНК-аффинного домена
https://doi.org/10.29235/1561-8323-2018-62-5-601-607
Аннотация
Одним из новых перспективных направлений молекулярной биотехнологии является бесклеточный синтез белка. Процедура бесклеточного синтеза белка основана на реконструкции in vitro всех этапов биосинтеза белка в клетке, включая транскрипцию, аминоацилирование тРНК и трансляцию мРНК рибосомами. Для воспроизведения этапа транскрипции требуется участие специфических РНК-полимераз, которые инициируют процесс синтеза мРНК с определенных сайтов узнавания. Часто для этого применяется ДНК-зависимая РНК-полимераза бактериофага Т7 (Т7-РНК-полимераза). Для улучшения качественных характеристик Т7-РНК-полимеразы в настоящей работе создан новый штамм Escherichia coli, продуцирующий этот фермент, слитый с ДНК-аффинным доменом Sso7d термофильной бактерии Sulfolobus solfataricus. Продуцирующая способность полученного рекомбинантного штамма в отношении синтезируемого химерного белка достигает 625 ед/л культуральной жидкости, а удельная активность препарата очищенного фермента составила 80 ед/мкг белка. Полученный фермент предназначен для использования в качестве инструментария при синтезе белков в бесклеточной системе.
Об авторах
И. С. Казловский
Национальная академия наук Беларуси, Институт микробиологии
Беларусь
Беларусь
Казловский Илья Сергеевич - магистр биологических наук, младший научный сотрудник.
Ул. Купревича, 2, 220141, МинскА. И. Зинченко
Национальная академия наук Беларуси, Институт микробиологии
Беларусь
Беларусь
Зинченко Анатолий Иванович - член-корреспондент, доктор биологических наук, профессор, заведующий лабораторией.
Ул. Купреви-ча, 2, 220141, Минск
Список литературы
1. Bundy, B. C. Escherichia coli-based cell-free synthesis of virus-like particles / B. C. Bundy, M. J. Franciszkowicz, J. R. Swartz // Biotechnol. Bioeng. - 2008. - Vol. 100, N 1. - P. 28-37. https://doi.org/10.1002/bit.21716
2. Bundy, B. C. Efficient disulfide bond formation in virus-like particles / B. C. Bundy, J. R. Swartz // J. Biotechnol. -2011. - Vol. 154, N 4. - P. 230-239. https://doi.org/10.1016/jjbiotec.2011.04.011
3. The incorporation of the A2 protein to produce novel QP virus-like particles using cell-free protein synthesis / M. T. Smith [et al.] // Biotechnol. Prog. - 2012. - Vol. 28, N 2. - P. 549-555. https://doi.org/10.1002/btpr.744
4. Cell-free synthesis of functional aquaporin Z in synthetic liposomes / N. T. Hovijitra [et al.] // Biotechnol. Bioeng. -2009. - Vol. 104, N 1. - P. 40-49. https://doi.org/10.1002/bit.22385
5. On-chip automation of cell-free protein synthesis: new opportunities due to a novel reaction mode / V. Georgi [et al.] // Lab. Chip. - 2016. - Vol. 16, N 2. - P. 269-281. https://doi.org/10.1039/c5lc00700c
6. Caschera, F. Preparation of amino acid mixtures for cell-free expression systems / F. Caschera, V. Noireaux // Biotechniq. - 2015. - Vol. 58. - P. 40-43. https://doi.org/10.2144/000114249
7. Roberts, J. W. Termination factor for RNA synthesis / J. W. Roberts // Nature. - 1969. - Vol. 224, N 5225. - P. 11681174. https://doi.org/10.1038/2241168a0
8. Studier, F. W. T7 expression systems for inducible production of proteins from cloned genes in E. coli / F. W. Studier // Curr. Protoc. Mol. Biol. - 2018. - Vol. 124, N 1. - e63. https://doi.org/10.1002/cpmb.63
9. Создание рекомбинантного штамма Escherichia coli - продуцента РНК-полимеразы бактериофага Т7 / И. С. Казловский [и др.] // Микробные биотехнологии: фундаментальные и прикладные аспекты. - Минск: Беларуская навука, 2016. - Т. 8. - С. 72-81.
10. A novel strategy to engineer DNA polymerases for enhanced processivity and improved performance in vitro / Y. Wang [et al.] // Nucleic Acids Res. - 2004. - Vol. 32, N 3. - P. 1197-1207. https://doi.org/10.1093/nar/gkh271
11. Production of thermostable DNA polymerase suitable for whole-blood polymerase chain reaction / A. S. Korovashkina [et al.] // Biochemistry and Biotechnology: Research and Development / eds. S. D. Varfolomeev, G. E. Zaikov, L. P. Krylova. -New York: Nova Science Publishers, Inc., 2012. - Р. 1-5.
12. Quan, J. Circular polymerase extension cloning of complex gene libraries and pathways / J. Quan, J. Tian // PLoS ONE. - 2009. - Vol. 4, N 7. - e6441. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0006441
13. You, C. Simple cloning via direct transformation of PCR product (DNA multimer) to Escherichia coli and Bacillus subtilis / C. You, X. Z. Zhang, Y. H. P. Zhang // Appl. Environ. Microbiol. - 2012. - Vol. 78, N 5. - P. 1593-1595. https://doi. org/10.1128/aem.07105-11
14. Construction and expression of a modular gene encoding bacteriophage T7 RNA polymerase / N. Arnaud [et al.] // Gene. -1997. - Vol. 199, N 1-2. - P. 149-156. https://doi.org/10.1016/s0378-1119(97)00362-4
Рецензия
Просмотров: 1232
Послать статью по эл. почте 