Физико-химические свойства Δ3−12 цистеин-обедненного цитохрома P450 3A4 с аминокислотной заменой S291C

Цитохром P450 3A4 (3A4) экспрессируется в клетках печени человека и играет ключевую роль в метаболизме ксенобиотиков, в том числе и более 50 % лекарственных препаратов. Регуляция активности данного фермента может происходить на уровне экспрессии генов, а также на уровне конформационного состояния структуры самого белка, за счет изменения молекулярного окружения, в том числе за счет взаимодействия с высокомолекулярными эффекторами. Понимание изменения структуры и динамики 3A4 в ответ на изменение условий среды необходимо для предсказания изменения уровня его активности, который в значительной степени обуславливает гомеостаз организма. Для проведения in vitro экспериментов по исследованию структуры, динамики и белоклигандных/белковых взаимодействий ферментов современными спектральными методами используется подход, в котором в целевой белок селективно вводятся методами белковой инженерии цистеиновые остатки в заданные локусы полипептидной цепи для последующего мечения специализированными молекулярными метками. Для этих целей в данной работе была получена мутантная форма мембрансвязанного (полноразмерного) рекомбинантного цитохрома P450 3A4 человека C58A/C64M/C98A/C239T/C377A/C468S/S291C. По данным спектроскопии кругового дихроизма нами было установлено, что введенные мутации не вызывают значимых изменений во вторичной структуре полученной формы 3A4, что свидетельствует о сохранении свернутости полипептидной цепи. Проведены спектрофотометрические измерения для сравнительного анализа изменения сродства к лигандам активного центра. Более того, нами было показано, что тестостерон гидроксилирующая активность в in vitro реконструированной системе для данной мутантной формы 3A4 многократно увеличивается относительно дикой формы фермента.

1. Guengerich, F. P. Human cytochrome P450 enzymes / F. P. Guengerich // Cytochrome P450. – Springer, Cham, 2015. – P. 597–607.

2. The structure of human microsomal cytochrome P450 3A4 determined by X-ray crystallography to 2.05-Å resolution / J. K. Yano [et al.] // J. Biol. Chem. – 2004. – Vol. 279, N 37. – P. 38091–38094. https://doi.org/10.1074/jbc.c400293200

3. Ekroos, M. Structural basis for ligand promiscuity in cytochrome P450 3A4 / M. Ekroos, T. Sjögren // Proceedings of the National Academy of Sciences. – 2006. – Vol. 103, N 37. – P. 13682–13687. https://doi.org/10.1073/pnas.0603236103

4. Sevrioukova, I. F. Dissecting cytochrome P450 3A4–ligand interactions using ritonavir analogues / I. F. Sevrioukova, T. L. Poulos // Biochemistry. – 2013. – Vol. 52, N 26. – P. 4474–4481. https://doi.org/10.1021/bi4005396

5. Structure-based ligand design to overcome CYP inhibition in drug discovery projects / G. Brändén [et al.] // Drug Discovery Today. – 2014. – Vol. 19, N 7. – P. 905–911. https://doi.org/10.1016/j.drudis.2014.03.012

6. Sevrioukova, I. F. Anion-dependent stimulation of CYP3A4 monooxygenase / I. F. Sevrioukova, T. L. Poulos // Biochemistry. – 2015. – Vol. 54, N 26. – P. 4083–4096. https://doi.org/10.1021/acs.biochem.5b00510

7. Membrane-attached mammalian cytochromes P450: An overview of the membrane’s effects on structure, drug binding, and interactions with redox partners / M. Šrejber [et al.] // J. Inorg. Biochem. – 2018. – Vol. 183. – P. 117–136. https://doi.org/10.1016/j.jinorgbio.2018.03.002

8. Hackett, J. C. Membrane-embedded substrate recognition by cytochrome P450 3A4 / J. C. Hackett // J. Biol. Chem. – 2018. – Vol. 293, N 11. – P. 4037–4046. https://doi.org/10.1074/jbc.ra117.000961

9. Site‐specific labelling of proteins with a rigid lanthanide‐binding tag / X. C. Su [et al.] // ChemBioChem. – 2006. – Vol. 7, N 10. – P. 1599–1604. https://doi.org/10.1002/cbic.200600142

10. A Chiral Lanthanide Tag for Stable and Rigid Attachment to Single Cysteine Residues in Proteins for NMR, EPR and Time‐Resolved Luminescence Studies / I. D. Herath [et al.] // Chemistry – A European Journal. – 2021. – Vol. 27, N 51. – P. 13009–13023. https://doi.org/10.1002/chem.202101143

11. Site-specific fluorescent labeling and oriented immobilization of a triple mutant of CYP3A4 via C64 / A. Ménard [et al.] // Bioconjugate Chemistry. – 2012. – Vol. 23, N 4. – P. 826–836. https://doi.org/10.1021/bc200672s

12. Polic, V. Allosteric activation of cytochrome P450 3A4 via progesterone bioconjugation / V. Polic, K. Auclair // Bioconjugate Chemistry. – 2017. – Vol. 28, N 4. – P. 885–889. https://doi.org/10.1021/acs.bioconjchem.6b00604

13. Sevrioukova, I. F. High-level production and properties of the cysteine-depleted cytochrome P450 3A4 / I. F. Sevrioukova // Biochemistry. – 2017. – Vol. 56, N 24. – P. 3058–3067. https://doi.org/10.1021/acs.biochem.7b00334

14. Mechanism of interactions of α-naphthoflavone with cytochrome P450 3A4 explored with an engineered enzyme bearing a fluorescent probe / T. N. Tsalkova [et al.] // Biochemistry. – 2007. – Vol. 46, N 1. – P. 106–119. https://doi.org/10.1021/bi061944p

15. Effect of glutathione on homo-and heterotropic cooperativity in cytochrome P450 3A4 / D. R. Davydov [et al.] // Archives of Biochemistry and Biophysics. – 2008. – Vol. 471, N 2. – P. 134–145. https://doi.org/10.1016/j.abb.2008.01.001

16. Peripheral ligand-binding site in cytochrome P450 3A4 located with fluorescence resonance energy transfer (FRET) / D. R. Davydov [et al.] // J. Biol. Chem. – 2012. – Vol. 287, N 9. – P. 6797–6809. https://doi.org/10.1074/jbc.m111.325654

17. A large-scale allosteric transition in cytochrome P450 3A4 revealed by luminescence resonance energy transfer (LRET) / E. V. Sineva [et al.] // PLoS One. – 2013. – Vol. 8, N 12. – Art. e83898. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0083898

18. Interactions among cytochromes P450 in microsomal membranes: oligomerization of cytochromes P450 3A4, 3A5, and 2E1 and its functional consequences / D. R. Davydov [et al.] // J. Biol. Chem. – 2015. – Vol. 290, N 6. – P. 3850–3864. https://doi.org/10.1074/jbc.m114.615443

19. Conformational mobility in cytochrome P450 3A4 explored by pressure-perturbation EPR spectroscopy / D. R. Davydov [et al.] // Biophys. J. – 2016. – Vol. 110, N 7. – P. 1485–1498. https://doi.org/10.1016/j.bpj.2016.02.026

20. Porath, J. Immobilized metal affinity adsorption and immobilized metal affinity chromatography of biomaterials. Serum protein affinities for gel-immobilized iron and nickel ions / J. Porath, B. Olin // Biochemistry. – 1983. – Vol. 22, N 7. – P. 1621–1630. https://doi.org/10.1021/bi00276a015

21. Morrison, J. F. Kinetics of the reversible inhibition of enzyme-catalysed reactions by tight-binding inhibitors / J. F. Morrison // Biochimica et Biophysica Acta (BBA) – Enzymology. – 1969. – Vol. 185, N 2. – P. 269–286. https://doi.org/10.1016/0005-2744(69)90420-3

22. Expression of modified human cytochrome P450 3A4 in Escherichia coli and purification and reconstitution of the enzyme / E. M. J. Gillam [et al.] // Archives of Biochemistry and Biophysics. – 1993. – Vol. 305, N 1. – P. 123–131. https://doi.org/10.1006/abbi.1993.1401

23. AMBER16 package / D. A. Case [et al.]. – San Francisco, 2016.

24. CHARMM‐GUI: a web‐based graphical user interface for CHARMM / S. Jo [et al.] // J. Comp. Chem. – 2008. – Vol. 29, N 11. – P. 1859–1865. https://doi.org/10.1002/jcc.20945

25. Frank, D. J. Analysis of heterotropic cooperativity in cytochrome P450 3A4 using α-naphthoflavone and testosterone / D. J. Frank, I. G. Denisov, S. G. Sligar // J. Biol. Chem. – 2011. – Vol. 286, N 7. – P. 5540–5545. https://doi.org/10.1074/jbc.m110.182055