Гетерологичная экспрессия диаденилатциклазы в виде телец включения, обладающих ферментативной активностью

С помощью техники рекомбинантной ДНК создан новый бактериальный штамм Escherichia coli ДАЦ-22, клетки которого способны осуществлять гетерологичную экспрессию диаденилатциклазы Bacillus thuringiensis – фермента, катализирующего реакцию трансформации аденозин-5′-трифосфата в циклический 3′,5′-диаденилат (цикло-ди-АМФ). Для получения этого штамма в качестве клеток-реципиентов плазмиды pET42a+ со встроенным геном disA, кодирующим диаденилатциклазу B. thuringiensis, впервые были использованы клетки E. coli «Rosetta (DE3) pLysS». Клетки нового штамма способны продуцировать гетерологичную диаденилатциклазу, около 90 % которой локализовано во фракции каталитически активных телец включения. Продуцирующая способность полученного штамма в отношении диаденилатциклазы, находящейся в составе каталитически активных телец включения, составила 720 ед/л культуральной жидкости. Образуемые этим штаммом тельца включения могут быть использованы в технологии получения фармакологически перспективного цикло-ди-АМФ.

1. A decade of research on the second messenger c-di-AMP / W. Yin [et al.] // FEMS Microbiol. Rev. – 2020. – Vol. 44, N 6. – P. 701–724. https://doi.org/10.1093/femsre/fuaa019

2. Intranasal delivery of influenza rNP adjuvanted with c-di-AMP induces strong humoral and cellular immune responses and provides protection against virus challenge / M. V. Sanchez [et al.] // PLoS ONE. – 2014. – Vol. 9, N 8. – Art. e104824. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0104824

3. Cyclic di-adenosine monophosphate: a promising adjuvant candidate for the development of neonatal vaccines / D. Lirussi [et al.] // Pharmaceutics. – 2021. – Vol. 13, N 2. – Art. 188. https://doi.org/10.3390/ pharmaceutics13020188

4. Yan, H. The Promise and challenges of cyclic dinucleotides as molecular adjuvants for vaccine development / H. Yan, W. Chen // Vaccines. – 2021. – Vol. 9, N 8. – Art. 917. https://doi.org/10.3390/vaccines9080917

5. Chemical synthesis, purification, and characterization of 3′-5′-linked canonical cyclic dinucleotides (CDNs) / C. Wang [et al.] // Meth. Enzymol. – 2019. – Vol. 625. – P. 41−59. https://doi.org/10.1016/bs.mie.2019.04.022

6. Villaverde, A. Protein aggregation in recombinant bacteria: Biological role of inclusion bodies / A. Villaverde, M. M. Carrio // Biotechnol. Lett. – 2003. – Vol. 25, N 17. – P. 1385–1395. https://doi.org/10.1023/a:1025024104862

7. Schramm, F. D. Protein aggregation in bacteria / F. D. Schramm, K. Schroeder, K. Jonas // FEMS Microbiol. Rev. – 2020. – Vol. 44, N 1. – P. 54–72. https://doi.org/10.1093/femsre/fuz026

8. Enzymatic synthesis of 2′-ara and 2′-deoxy analogues of c-di-GMP / A. S. Shchokolova [et al.] // Nucleos. Nucleot. Nucl. Acids. – 2015. – Vol. 34, N 6. – P. 416–423. https://doi.org/10.1080/15257770.2015.1006775

9. Thermostable adenosine 5′-monophosphate phosphorylase from Thermococcus kodakarensis forms catalytically active inclusion bodies / S. Kamel [et al.] // Sci. Rep. – 2021. – Vol. 11, N 1. – Art. 16880. https://doi.org/10.1038/s41598- 021-96073-5

10. Re-engineered BCG overexpressing cyclic di-AMP augments trained immunity and exhibits improved efficacy against bladder cancer / A. K. Singh [et al.] // Nat. Commun. – 2022. – Vol. 13, N 1. – Art. 878. https://doi.org/10.1038/s41467- 022-28509-z

11. Cyclic di-AMP homeostasis in Bacillus subtilis: both lack and high level accumulation of the nucleotide are detrimental for cell growth / F. M. Mehne [et al.] // J. Biol. Chem. – 2013. – Vol. 288, N 3. – P. 2004–2017. https://doi.org/10.1074/jbc. m112.395491

12. Создание рекомбинантного штамма Escherichia coli – продуцента диаденилатциклазы и ее использование для синтеза цикло-ди-АМФ / И. С. Казловский [и др.] // Вес. Нац. акад. навук Беларусi. Сер. бiял. навук. – 2015. – № 4. – С. 51–55.

13. Green, M. R. Molecular cloning. A laboratory manual. 4th ed. / M. R. Green, J. Sambrook. – New York, 2012. – 630 p.

14. Quan, J. Circular polymerase extension cloning of complex gene libraries and pathways / J. Quan, J. Tian // PLoS ONE. – 2009. – Vol. 4, N 7. – Art. e6441. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0006441

15. Challenges associated with the formation of recombinant protein inclusion bodies in Escherichia coli and strategies to address them for industrial applications / A. Bhatwa [et al.] // Front. Bioeng. Biotechnol. – 2021. – Vol. 9. – Art. 630551. https:// doi.org/10.3389/fbioe.2021.630551