Модифицированная лентивирусная векторная система для эффективного введения и долговременной экспрессии генов в дендритных клетках человека

Дендритные клетки (ДК) содержат высокую концентрацию антивирусного фактора SAMHD1, который ингибирует размножение лентивирусов. Некоторые представители лентивирусов обезьян, такие как SIVmac, кодируют вспомогательный белок Vpx, который является антогонистом SAMHD1 и блокирует его действие в инфицируемых клетках для повышения эффективности размножения. Однако лентивирус человека HIV-1, на основе которого получены подавляющее большинство векторных систем для введения и экспрессии генов, не кодирует Vpx и инфицирует ДК с низкой эффективностью. Исходя из этого, было сделано предположение, что упаковка Vpx белка SIVmac в вирионы лентивирусных векторов на основе HIV-1 может увеличивать их инфекционность на ДК. Для придания лентивирусной векторной системе на основе HIV-1 способности упаковывать в вирионы белок Vpx SIVmac239 в векторную систему были введены ряд изменений. На основе анализа структурной и функциональной гомологии белков p6 HIV-1 и SIVmac239 были определены аминокислотные последовательности, замена которых в составе p6 HIV-1 позволяла бы специфически упаковывать экзогенный белок Vpx SIVmac239 и оказывала минимальное влияние на структуру белка. Для экспрессии белка Vpx SIVmac239 в клетках человека была получена кодон-оптимизированная последовательность гена Vpx. Результаты показали, что упаковка Vpx белка в вирионы модифицированных лентивирусов является критичной для их инфекционности на ДК, так как вирус «дикого типа», полученный даже в присутствии Vpx белка, был не способен продуктивно инфицировать ДК, поскольку не содержит белковых детерминант для упаковки Vpx. Эффективность введения маркерного гена в ДК при помощи модифицированной векторной системы для различных доноров составила 90–97 %. Отличительной особенностью векторной системы является ее способность упаковывать Vpx белок SIVmac непосредственно в вирионы HIV-1, что дает возможность напрямую вводить вирусные векторы на основе HIV-1 в ДК, без предварительной их обработки обезьяньим вирусом SIVmac. Таким образом, модифицированная векторная система может быть использована для эффективного введения и долговременной экспрессии генов в ДК человека.

1. Steinman, R. M. Decisions about dendritic cells: past, present, and future / R. M. Steinman // Annual Review of Immunology. – 2012. – Vol. 30. – P. 1–22. https://doi.org/10.1146/annurev-immunol-100311-102839

2. Steinman, R. M. Taking dendritic cells into medicine / R. M. Steinman, J. Banchereau // Nature. – 2007. – Vol. 449. – P. 419–426. https://doi.org/10.1038/nature06175

3. Targeted delivery of TLR ligands to human and mouse dendritic cells strongly enhances adjuvanticity / P. J. Tacken, I. S. Zeelenberg, L. J. Cruz [et al.] // Blood. – 2011. – Vol. 118, N 26. – P. 6836–6844. https://doi.org/10.1182/blood-2011-07-367615

4. Naldini, L. Lentiviruses as gene transfer agents for delivery to non-dividing cells / L. Naldini // Current Opinion in Biotechnology. – 1998. – Vol. 9, N 5. – P. 457–463. https://doi.org/10.1016/s0958-1669(98)80029-3

5. SAMHD1 restricts the replication of human immunodeficiency virus type 1 by depleting the intracellular pool of deoxynucleoside triphosphates / H. Lahouassa, W. Daddacha, H. Hofmann [et al.] // Nature Immunology. – 2012. – Vol. 13. – P. 223–228. https://doi.org/10.1038/ni.2236

6. SAMHD1 is the dendriticand myeloid-cell-specific HIV-1 restriction factor counteracted by Vpx / N. Laguette, B. Sobhian, N. Casartelli [et al.] // Nature. – 2011. – Vol. 474. – P. 654–657. https://doi.org/10.1038/nature10117

7. Vpx relieves inhibition of HIV-1 infection of macrophages mediated by the SAMHD1 protein / K. Hrecka, C. Hao, M. Gierszewska [et al.] // Nature. – 2011. – Vol. 474. – P. 658–661. https://doi.org/10.1038/nature10195

8. With a little help from a friend: increasing HIV transduction of monocyte-derived dendritic cells with virion-like particles of SIVMAC / C. Goujon, L. Jarrosson-Wuilleme, J. Bernaud [et al.] // Gene Therapy. – 2006. – Vol. 13. – P. 991–994. https://doi.org/10.1038/sj.gt.3302753

9. A cryptic sensor for HIV-1 activates antiviral innate immunity in dendritic cells / N. Manel, B. Hogstad, Ya. Wang [et al.] // Nature. – 2010. – Vol. 467. – P. 214–217. https://doi.org/10.1038/nature09337

10. Sambrook, J. F. Molecular cloning: a laboratory manual / J. Sambrook. – Cold Spring Harbor, 2001. – 3d ed.

11. A conserved dileucine-containing motif in p6gag governs the particle association of Vpx and Vpr of simian immunodeficiency viruses SIVmac and SIVagm / M. A. Accola, A. A. Bukovsky, M. S. Jones, H. G. Gottlinger // Journal of Virology. – 1999. – Vol. 73, N 12. – P. 9992–9999. https://doi.org/10.1128/JVI.73.12.9992-9999.1999

12. Solution structure of the human immunodeficiency virus type 1 p6 protein / T. Fossen, V. Wray, K. Bruns [et al.] // Journal of Biological Chemistry. – 2005. – Vol. 280, N 52. – P. 42515–42527. https://doi.org/10.1074/jbc.M507375200

13. Identification and structural characterization of the ALIX-binding late domains of simian immunodeficiency virus SIVmac239 and SIVagmTan-1 / Q. Zhai, M. B. Landesman, H. Robinson [et al.] // Journal of Virology. – 2011. – Vol. 85, N 1. – P. 632–637. https://doi.org/10.1128/JVI.01683-10

14. Kondo, E. A conserved LXXLF sequence is the major determinant in p6gag required for the incorporation of human immunodeficiency virus type 1 Vpr / E. Kondo, H. G. Gottinger // Journal of Virology. – 1996. – Vol. 70, N 1. – P. 159–164. https://doi.org/10.1128/JVI.70.1.159-164.1996

15. Zhu, H. Identification of the 15FRFG domain in HIV-1 Gag p6 essential for Vpr packaging into the virion / H. Zhu, H. Jian, L. J. Zhao // Retrovirology. – 2004. – Vol. 1. – Art. 26. https://doi.org/10.1186/1742-4690-1-26