РАЗНОСТНАЯ ЯМР СПЕКТРОСКОПИЯ С ПЕРЕНОСОМ НАСЫЩЕНИЯ В ИССЛЕДОВАНИИ ВЗАИМОДЕЙСТВИЯ ЦИТОХРОМА Р450cam С 4-ФЕНИЛИМИДАЗОЛОМ: ОБНАРУЖЕНИЕ НОВОГО ПРОМЕЖУТОЧНОГО СОСТОЯНИЯ КОМПЛЕКСА

Настоящая работа посвящена исследованию взаимодействия цитохрома P450cam c 4-фенилимидазолом (4-PI) методом спектрофотометрии и ЯМР спектроскопии. Полученные методом разницы переноса насыщения ЯМР (РПН-ЯМР) данные указывают на существование промежуточного короткоживущего состояния 4-фенилимидазола в активном сайте P450cam, где 4-фенилимидазол связан с внутренней областью активного сайта и/или областью канала доступа субстрата без образования координационной связи между атомами азольной группы лиганда и атомом железа гема. В данной работе нами впервые применен метод РПН-ЯМР для исследования взаимодействия цитохрома P450 c лигандом. Равновесная константа диссоциации комплекса P450cam–4-PI, рассчитанная с использованием зависимости фактора амплификации РПН при нулевом времени насыщения, составляет 10,4 мМ и отличается от константы, рассчитанной при постоянном времени насыщения (34,6 мМ), что указывает на зависимость определения Kd при использовании РПН-ЯМР от времени насыщения и концентраций взаимодействующих веществ. Сравнение энергии диссоциации для промежуточного комплекса (11,2 кДж) относительно комплекса с прямой координацией (28,5 кДж) позволяет предположить, что основной вклад во взаимодействие белок–лиганд вносит гидрофобное взаимодействие 4-PI с внутренней поверхностью полости активного сайта Р450cam. Обнаруженное промежуточное состояние позволяет объяснить образование гидроксилированных форм ингибиторов азольной природы при взаимодействии с цитохромами P450, когда ингибитор находится в промежуточной форме в качестве субстрата, без образования координационной связи с атомом железа гема. 

1. Hrycay, E. G. Monooxygenase, Peroxidase and Peroxygenase Properties and Mechanisms of Cytochrome P450 / E. G. Hrycay, S. M. Bandiera // Advances in Experimental Medicine and Biology. – 2015. – Vol. 851. – 368 p. doi. org/10.1007/978-3-319-16009-2

2. Isin, E. M. Substrate binding to cytochromes P450 / E. M. Isin, F. P. Guengerich // Analytical and bioanalytical chemistry. – 2008. – Vol. 392, N 6. – P. 1019–1030. doi.org/10.1007/s00216-008-2244-0

3. Aguirre, C. Overview of Probing Protein-Ligand Interactions Using NMR / C. Aguirre, O. Cala, I. Krimm // Current Protocols in Protein Science. – 2015. – P. 17.18.1–17.18.24. doi.org/10.1002/0471140864.ps1718s81

4. Cala, O. NMR-based analysis of protein–ligand interactions / O. Cala, F. Guillière, I. Krimm // Analytical and bioanalytical chemistry. – 2014. – Vol. 406, N 4. – P. 943–956. doi.org/10.1007/s00216-013-6931-0

5. Mayer, M. Group epitope mapping by saturation transfer difference NMR to identify segments of a ligand in direct contact with a protein receptor / M. Mayer, B. Meyer // Journal of the American Chemical Society. – 2001. – Vol. 123, N 25. – P. 6108–6117. doi.org/10.1021/ja0100120

6. Angulo, J. STD-NMR: application to transient interactions between biomolecules – a quantitative approach / J. Angulo, P. M. Nieto // European Biophysics Journal. – 2011. – Vol. 40, N 12. – P. 1357–1369. doi.org/10.1007/s00249-011-0749-5

7. Direct observation of ligand binding to membrane proteins in living cells by a saturation transfer double difference (STDD) NMR spectroscopy method shows a significantly higher affinity of integrin αIIbβ3 in native platelets than in liposomes / B. Claasen [et al.] // Journal of the American Chemical Society. – 2005. – Vol. 127, N 3. – P. 916–919. doi. org/10.1021/ja044434w

8. Direct detection of ligand binding to Sepharose-immobilised protein using saturation transfer double difference (STDD) NMR spectroscopy / T. Haselhorst [et al.] // Biochemical and biophysical research communications. – 2007. – Vol. 359, N 4. – P. 866–870. doi.org/10.1016/j.bbrc.2007.05.204

9. Jayalakshmi, V. Complete relaxation and conformational exchange matrix (CORCEMA) analysis of intermolecular saturation transfer effects in reversibly forming ligand-receptor complexes / V. Jayalakshmi, N. R. Krishna // Journal of Magnetic Resonance. – 2002. – Vol. 155, N 1. – P. 106–118. doi.org/10.1006/jmre.2001.2499

10. Godamudunage, M. P. Comparison of Cytochrome P450 3A4 and 3A7 with Azole Inhibitors / M. P. Godamudunage, J. N. Lampe, E. E. Scott // FASEB Journal. – 2017. – Vol. 31, N 1. – P. 669.5.

11. Sevrioukova, I. F. Structural biology of redox partner interactions in P450cam monooxygenase: a fresh look at an old system / I. F. Sevrioukova, T. L. Poulos // Archives of biochemistry and biophysics. – 2011. – Vol. 507, N 1. – P. 66–74. doi. org/10.1016/j.abb.2010.08.022

12. Mueller, E. J. Twenty-five years of P450cam research / E. J. Mueller, P. J. Loida, S. G. Sligar // Cytochrome P450. – Springer US, 1995. – P. 83–124. doi.org/10.1007/978-1-4757-2391-5_3

13. The 2.6-A crystal structure of Pseudomonas putida cytochrome P-450 / T. L. Poulos [et al.] // Journal of Biological Chemistry. – 1985. – Vol. 260, N 30. – P. 16122–16130.

14. Conformational states of cytochrome P450cam revealed by trapping of synthetic molecular wires / A. M. A. Hays [et al.] // Journal of molecular biology. – 2004. – Vol. 344, N 2. – P. 455–469. doi.org/10.1016/j.jmb.2004.09.046

15. Three clusters of conformational states in p450cam reveal a multistep pathway for closing of the substrate access channel / Y. T. Lee [et al.] // Biochemistry. – 2011. – Vol. 50, N 5. – P. 693–703. doi.org/10.1021/bi101726d

16. Poulos, T. L. Crystal structures of metyrapone- and phenylimidazole-inhibited complexes of cytochrome P-450cam / T. L. Poulos, A. J. Howard // Biochemistry. – 1987. – Vol. 26, N 25. – P. 8165–8174. doi.org/10.1021/bi00399a022

17. Lipscomb, J. D. Structural aspects of the active site of cytochrome P-450cam / J. D. Lipscomb, I. C. Gunsalus // Drug Metabolism and Disposition. – 1973. – Vol. 1, N 1. – P. 1–5.

18. Saturation Transfer Difference (STD) NMR Spectroscopy Characterization of Dual Binding Mode of a Mannose Disaccharide to DC-SIGN / J. Angulo [et al.] // ChemBioChem. – 2008. – Vol. 9, N 14. – P. 2225–2227. doi.org/10.1002/ cbic.200800361

19. Prasad, S. Binding of camphor to Pseudomonas putida cytochrome P450cam: steady-state and picosecond timeresolved fluorescence studies / S. Prasad, S. Mazumdar, S. Mitra // FEBS letters. – 2000. – Vol. 477, N 3. – P. 157–160. doi. org/10.1016/s0014-5793(00)01745-2

20. Crystal structure of the cytochrome P-450CAM active site mutant Thr252Ala / R. Raag [et al.] // Biochemistry. – 1991. – Vol. 30, N 48. – P. 11420–11429. doi.org/10.1021/bi00112a008

21. Surface plasmon resonance analysis of antifungal azoles binding to CYP3A4 with kinetic resolution of multiple binding orientations / J. T. Pearson [et al.] // Biochemistry. – 2006. – Vol. 45, N 20. – P. 6341–6353. doi.org/10.1021/bi0600042

22. Fernando, H. Resolution of Multiple Substrate Binding Sites in Cytochrome P450 3A4: The Stoichiometry of the Enzyme-Substrate Complexes Probed by FRET and Job’s Titration / H. Fernando, J. R. Halpert, D. R. Davydov // Biochemistry. – 2006. – Vol. 45, N 13. – P. 4199–4209. doi.org/10.1021/bi052491b

23. Davydov, D. R. Allosteric transitions in cytochrome P450eryF explored with pressure-perturbation spectroscopy, lifetime FRET, and a novel fluorescent substrate, Fluorol-7GA / D. R. Davydov, N. Y. Davydova, J. R. Halpert // Biochemistry. – 2008. – Vol. 47, N 43. – P. 11348–11359. doi.org/10.1021/bi8011803

24. Peripheral ligand-binding site in cytochrome P450 3A4 located with fluorescence resonance energy transfer (FRET) / D. R. Davydov [et al.] // Journal of Biological Chemistry. – 2012. – Vol. 287, N 9. – P. 6797–6809. doi.org/10.1074/jbc. m111.325654

25. Isin, E. M. Multiple sequential steps involved in the binding of inhibitors to cytochrome P450 3A4 / E. M. Isin, F. P. Guengerich // Journal of Biological Chemistry. – 2007. – Vol. 282, N 9. – P. 6863–6874. doi.org/10.1074/jbc.m610346200